什么是细菌内毒素LPS？

内毒素(Endotoxin)是一种脂多糖(LPS)，来源于革兰氏阴性细菌外膜，其细胞壁外膜的外部脂质成分由内毒素分子组成，细胞死亡或合成后被释放出来。LPS具有三个结构，由菌体特异性多糖、非特异性中心多糖和脂质A三部分构成。内毒素单体分子量为10kDa左右，在不同成分水溶液中，可构成大分子汇集体，大的可超越1000 kDa。类脂A是内毒素多种生物活性或毒性反响的主要基团。该基团没有种属特异性, 所以各属细菌的类脂A 结构相似, 其毒性反响相似，如发热、血液活动力学改动、洋溢性血管内凝血, 并招致休克等。O-特异多糖位于菌体胞壁的最外层，由若干重复的寡糖单位组成。多糖的种类与含量决议着细菌种、型的特异性，以及不同细菌间具有的共同抗原性。它还参与细菌的抗补体溶解作用。

内毒素不是蛋白质, 热稳定性强。在 100℃的高温下加热1h 也不会被破坏, 115℃30m in 湿热仅能破坏 25% 左右的热原质。只需 180℃ 3～ 4h 或 250℃ 1～ 2h 干烤, 或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸 30min才干破坏它的生物活性。

内毒素带有负电荷, 由于脂多糖结构中类脂 A 的疏水性, 使得内毒素倾向于以高分子聚合物的状态存在而难溶于水, 并由于环境中 Ca2+、Mg2+等被吸收到带负电荷的脂多糖上而得以稳定。通常其分子量几十万至上千万道尔顿。

内毒素的产生：

基因工程蛋白通常采用细菌、酵母、哺乳动物细胞或昆虫细胞作为宿主中止大范围发酵消费, 但大多是以大肠菌作为表白系统。以大肠杆菌作为表白系统的蛋白通常都是在胞内表白, 在纯化蛋白之前必须经过高压匀浆、超声波破碎或低压渗透等措施将菌种破壁, 以释放蛋白。同时细胞壁内的脂多糖也大量释放到缓冲液中, 通常 10% 的湿菌浓度可产生几万EU/mL 的内毒素, 这是内毒素的主要来源。

关于酵母表白系统或 CHO (中国仓鼠卵巢细胞系) 系统等, 固然表白系统自身不产生内毒素, 但在消费过程中因原辅资料, 消费环境以及个人操作等要素构成产品内毒素污染, 这是产生内毒素的另一来源。

在消费过程中如何避免内毒素污染：

①粗纯中避免内毒素污染 无论是酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞表白系统还是大肠杆菌表白系统, 在消费过程中以各种途径应用各种措施有效地避免内毒素污染均是十分重要的。前者自身不产生内毒素, 只需在消费过程中能有效避免内毒素的污染, 就能够得到热原合格的产品; 后者固然不可避免地产生内毒素, 但通常在初步纯化中已采取有效措施, 能够大量减少内毒素含量。

②经过无菌操作和控制操作区洁净度来避免外源性内毒素污染。首先, 消费车间必须是契合 GMP请求的洁净厂房, 各种不同的操作在不同的洁净区内中止, 例如发酵和粗纯应该在十万级区中止, 精纯在万级区域内中止, 制剂、分装须在百级间或层流罩下中止操作。关于任何非封锁系统的操作, 均应采取无菌操作方式, 假如系统自动化水平较高, 可遥控操作或较少手工操作。

③关于任何直接接触制品的溶液、容器、消费用具、管路、消费系统等必须中止严厉有效的处置, 去除热原。用蒸馏法或反渗法制备的新颖注射用水或灭菌注射用水通常都是无热原的, 这是清洗用具及配制溶液的基础。消费用具一类是玻璃器皿, 不锈钢制品, 这些用具可置180℃ 3～ 4h 或 250℃ 1～ 2h干烤, 除去热原。另一类为橡胶、塑料制品, 如胶塞、胶管等, 可采用 0.1M盐酸煮沸30min, 或 0.1M氢氧化钠浸泡 4h以上, 急用时可煮沸30min, 然后用新颖注射用水冲洗净, 再高压灭菌。关于生物制药的某些关键步骤可采用无菌、无热原的一次性用具, 既能够减轻劳动量, 又能够避免清洗不净带来的污染。溶液配制要运用无热原的新颖注射用水, 整个过程必须于 3h 内完成, 并及时高压灭菌。关于一些不能灭菌的溶液, 可经过超滤法除热原。如(PBS) 在高压灭菌时会产生具有紫外吸收的焦磷酸, 在运用磷酸盐液缓液(PBS) 中止柱层析时, 就对层析图谱产生干扰, 在干扰素的消费与检定中曾经呈现过这样的问题, 采用截留相对分子质量 (NMWL ) 为 10kDa的超滤膜超滤可有效去除溶液中的热原。

生物技术药品的消费中, 关于系统、管路的清洗触及在位清洗(CIP)/在位灭菌(SIP)的概念主要是针对泵、管道、阀门、滤器、柱、各种罐等需定期清洗灭菌的设备,常规请求在不拆任何组件的状况下原位中止。例如层析系统,它是生物技术药品消费中普遍运用的单元操作,在清洗/在位灭菌十分重要,有效的在位清能够减少产品污染的风险性、维持柱效和进步介质寿命。氢氧化钠被经常用作在位清洗时的清洗液。

细菌内毒素的检测：

细菌内毒素检查法系应用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素, 以判别供试品中细菌内毒素的含量能否契合规则的一种措施。鲎试剂法的反响机理是细菌内毒素在二价阳离子参与下激活鲎血细胞溶解物中的一系列凝聚酶的反响。其包含两种措施，即凝胶法和光度测定法，后者包含浊度法和显色基质 法。检测时可用其中任一种措施，当结果有争议时，另有规则外，以凝胶法结果为准。鲎试剂法具有烦琐、疾速、定量精确、灵活度高等优点，在国际上遭到普遍应用，已被美国、欧洲、日本等国《药典》及《生 物制品规程》收载，我国2005年版药典也已收载，应用于药品、生物制品的热原检定。

细菌内毒素的去除：

由于内毒素显著的危害性，FDA等法规也对内毒素的控制和将其降低到保险水平提出明白请求。无菌操作和操作区洁净度也是控制外源性内毒素污染的有效伎俩。但是关于样品自身就存在的内源性内毒素污染，即便外源性内毒素得到有效控制，最终工艺制备的样品也存在内毒素超标的风险。那么就需求从样品自身制备工艺角度，分离内毒素特性，寻觅有效措施，使样品自身内毒素(Endotoxin)降低，抵达工艺请求，进步产品保险性。

①疏水层洗法：普通来说内毒素的疏水性都是远远大于目的物的，因而在疏水层析上样需求高盐缓冲液均衡，内毒素在高盐下发作凝集，不分离疏水介质，因而上样时直接穿透而被去除。或者采取目的样品流穿方式，在一定盐浓度下使目的蛋白不分离填料，而内毒素分子可与填料分离，使两者完成分别。

②离子交流法：关于阴离子交流层析，内毒素在 pH>2时带负电荷，与阴离子交流介质Q或DEAE有较强分离, 可运用目的蛋白从阴离子交流填料流穿的方式去除内毒素；也可在目的蛋白和内毒素同时分离于层析介质上后，由于内毒素的分离才干较蛋白的分离才干强，因而可先将目的蛋白洗脱出来，然后再用高盐缓冲液或NaOH将内毒素洗出。关于阳离子交流层析，在pH4.0时，内毒素还是带有负电荷不能和填料分离而随活动相流出层析柱，目的蛋白则能够与阳离子交流介质分离，因而采用阳离子交流层析也能够很好的去除内毒素。此外，采用一些名义活性剂好比Triton X-114，既能阻止内毒素分离在阴离子柱上也可阻止内毒素分离在阳离子柱上。

③凝胶过滤层析：内毒素可在水溶液中以非极性和离子相互作用，构成大小为 1,000 kDa 分子汇集体，它与多数生物蛋白分子量差别较大，基于这一特征，能够采用凝胶过滤层析，将大分子内毒素分子与目的蛋白分别。但其处置量小, 处置时间较长。

④TFF切向流技术去除内毒素：内毒素在不同的水溶液中，常构成汇集体结构，因其汇集的水平不同，分子大小不一。小汇集体分子量为10~20 kDa，而大汇集体的分子量可达1000 kDa。运用切向流膜孔径小于内毒素的分子量而使内毒素分子截留，目的样品透过膜孔，抵达去除样品中内毒素的目的。影响蛋白溶液中内毒素去除要素主要包含，目的分子的大小散布、内毒素与目的分子的相互作用、目的蛋白质浓度以及能否添加相应的洗濯剂。

⑤经过亲合层析去除内毒素: 亲合层析技术, 特别是免疫吸附剂在消费中的运用使得生物大分子的纯化变得简单。免疫吸附的原理基于抗原、抗体的特异性作用, 以目的蛋白作为抗原, 将经过杂交瘤技术消费的单克隆抗体偶联于介质上, 以此介质来吸附目的蛋白。由于相互作用的高度特异性, 理论上仅有目的蛋白吸附于介质上, 内毒素全部穿透, 洗脱后将得到纯度很高的无热原产品。实践上, 由于介质自身存在的非特异性吸附, 仍有少量的杂蛋白和内毒素同时被吸附, 但内毒素含量是极低的。在干扰素(IFN)消费中, 洗脱物内毒素含量普通为0.25EU/mL。

⑥应用特异性吸附内毒素介质去除内毒素：将内毒素底物LAL或多粘菌素B(PMB)偶联于层析介质上, 以此介质特异性吸附内毒素, 而蛋白不会被该层析介质吸附随活动相流出，搜集该流出蛋白即可。该措施去除内毒素效果较好, 但有一定的蛋白损失。

总的来说，目前还没有适用于生物制药工艺中去除内毒素的通用计划。特别内毒素含量特别高的样品，单一方式去除效果不好时，需求分离不同生物制品和不同工艺的特性，思索多种方式组合以降低工艺过程的内毒素杂质，进步产品保险性，从而满足相关法规请求。

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