基于网络药理学和实验考证的麻黄细辛附子汤治疗变应性鼻炎 ...

2023-4-6 21:25| 发布者: 挖安琥| 查看: 343| 评论: 0

摘要: 变应性鼻炎（AR）是全球最常见的慢性疾病之一，是由过敏原刺激、免疫球蛋白E（IgE）介导的Ⅰ型反常反响，临床表示为鼻塞、鼻痒、喷嚏、流涕、嗅觉减退等［ 1］。盛行病学调查显现，全世界约有20%的人口患有AR，延展 ...

变应性鼻炎（AR）是全球最常见的慢性疾病之一，是由过敏原刺激、免疫球蛋白E（IgE）介导的Ⅰ型反常反响，临床表示为鼻塞、鼻痒、喷嚏、流涕、嗅觉减退等［ 1］。盛行病学调查显现，全世界约有20%的人口患有AR，延展中国度的发病率正逐步上升［ 2］。AR虽不至要挟患者生命，但它是许多并发症的基础，是哮喘控制不佳的主要风险要素，并严重影响工作、生活，降低社会生产力，构成庞大的经济损失［ 3］。

AR属中医学“鼻鼽”“鼽嚏”“鼽水”等范畴［ 4］，中医理论多以为本病表寒外束为标，而少阴阳虚为本，症似外感，却正气已虚，临床常用麻黄细辛附子汤发散风寒、温阳扶正［ 5-6］。麻黄细辛附子汤出自《伤寒论》，由麻黄、细辛、附子组成，方中麻黄发汗散寒以解太阳之表，附子温里助阳以扶少阴之虚，细辛通窍利肺，散寒破阴，以助麻附之用。大量临床和实验研讨均证明麻黄细辛附子汤对防治AR优势显著、效果突出［ 7-9］。药理学研讨表明，麻黄细辛附子汤具有抗炎、抗过敏、免疫调理等作用［ 10］，但其治疗AR的主要活性成分及分子机制尚未完整阐明。

网络药理学以疾病-基因-靶点-药物之间的相互作用为基础，从生物系统的角度构建相关网络，从而全面评价中药对疾病的潜在治疗作用［ 11-13］。本研讨拟采用网络药理学措施分离实验研讨讨论麻黄细辛附子汤治疗AR的潜在作用机制。

1资料与措施

1.1网络药理学和分子对接研讨

1.1.1麻黄细辛附子汤成分及靶点的获取经过中药系统药理学数据库与剖析平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）对麻黄细辛附子汤（麻黄、细辛、附子）各药活性成分进行检索，以口服生物应用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为条件进行选择，同时参考文献报道，弥补了11个未抵达选择规范，但含量高及生物学效能强的活性成分。在TCMSP平台对活性成分进行靶点预测，并经过UniProt（https：//www.uniprot.org/）数据库将靶点蛋白称号转化为对应的基因称号。

1.1.2AR靶点选择及中药-活性成分-靶点网络的绘制在GeneCards数据库（http：//www.genecards.org/）（relevance score≥1）、OMIM数据库（http：//www.omim.org/）、PharmGKB数据库（https：//www.pharmgkb.org/）、TTD数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/）和DrugBank数据库（https：//go.drugbank.com/）中以“allergic rhinitis”为关键词进行检索，将5个数据库的结果取并集并删除重复值，即为AR相关靶点。运用Venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）工具，将麻黄细辛附子汤成分相关靶点与AR靶点取交集并绘制韦恩图。交集靶点导入Cytoscape 3.7.1软件，绘制中药-活性成分-靶点网络。

1.1.3蛋白质相互作用（PPI）网络的构建应用STRING平台（https：//string-db.org/cgi/input.pl）对交集靶点进行PPI网络构建，设置物种为“Homo sapiens”，蛋白相互作用阈值设定为“Medium confidence”（0.400），所得结果由Cytoscape进行可视化处置，运用Cytoscape-CytoNCA插件进行剖析，选择出中心靶点。

1.1.4基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集剖析应用R言语对交集靶点进行GO和KEGG富集剖析，限定P＜0.05，物种为人类。将GO中排名前10的细胞组分（CC）、分子功用（MF）、生物过程（BP）及KEGG排名前30的通路按P值升序排序制造气泡图。

1.1.5分子对接分子对接考证关键活性成分槲皮素、山柰酚、芹菜素、木犀草素、伪麻黄碱、麻黄碱、豆甾醇与中心靶点前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）、转录因子AP-1（JUN）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）、蛋白激酶B1（AKT1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的分离活性。经过PubChem平台获取主要活性成分的2D SDF结构，应用ChemBio3D对其能量最小化处置，经过RSCB PDB（http：//www.rcsb.org/）数据库获取关键靶点的蛋白质结构，应用PyMol去除水和小分子配体，经AutoDockTools加氢原子后转换成PDBQT格式用于对接，运用AutoDock Vina对接并评价其分离才干，用Pymol软件可视化处置。

1.2体外细胞实验考证

1.2.1 资料（1）细胞：人鼻黏膜上皮细胞（HNEpC）购于北纳创联生物科技有限公司（货号：356247）。（2）组方药材及水煎液制备：麻黄、细辛、附子3味中药均购自北京仟草中药饮片有限公司，批号分别为190220004、190424006、190314002，经北京中医药大学中药学院杨瑶珺教授审定：麻黄为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinicaStapf的单调草质茎，细辛为马兜铃科植物北细辛Asarum heterotropoidesFr. Schmidt var. mandshuricum （Maxim.）Kitag.的单调根及根茎，附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeliDebx. 的子根的加工品，均契合《中国药典》2020年版规范，质量良好。称取麻黄6 g、细辛3 g、附子9 g，常规措施煎煮，浓缩，制成1 g·mL-1水煎液，4 ℃、12 000 r·min-1离心30 min，搜集上清液，0.22 μm细菌滤器滤过后置于-20 ℃备用。（3）试剂与仪器：EMEM培育基购自上海逍鹏生物有限公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；脂多糖（LPS）购自美国Sigma公司；CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自北京兰博利德商贸有限公司；白细胞介素-8（IL-8）ELISA试剂盒购自江苏科特生物科技有限公司；白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒购自江苏酶标生物科技有限公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、SYBR Green预混型qPCR试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；所用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）引物由北京鼎国昌盛生物技术有限义务公司合成，见表1。多功用酶标仪，美国Thermo公司；流式细胞仪，美国BD Biosciences公司；qRT-PCR仪，美国Bio-Rad公司。

1.2.2细胞培育HNEpC以EMEM完整培育基（含10%胎牛血清及1%双抗），置于37 ℃、5% CO 2 培育箱内培育，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.3CCK-8法检测细胞存活率将HNEpC以每孔5×10 4 个接种于96孔板中，培育箱内培育24 h，空白组（不含细胞）、对照组内参与培育基，麻黄细辛附子汤组依次参与1、5、10、20、50 mg·mL-1不同质量浓度的麻黄细辛附子汤水煎液，24 h后参与10 μL CCK-8溶液，培育箱内避光孵育30 min，450 nm处测定各孔吸光度（A）值，计算细胞存活率。

细胞存活率＝（A给药－A空白）/（A对照－A空白）

1.2.4麻黄细辛附子汤对LPS诱导HNEpC细胞炎症因子、细胞凋亡及中心靶点mRNA表白的影响将HNEpC以每孔5×10 5 个接种于6孔板中，培育箱内培育24 h后进行干预给药。分为对照组、模型组（5 μg·mL-1LPS）及低、中、高质量浓度麻黄细辛附子汤组（5 μg·mL-1LPS＋5、10、20 mg·mL-1麻黄细辛附子汤水煎液），继续培育24 h后，搜集细胞和上清用于后续实验研讨。

（1）ELISA法检测各组细胞上清IL-6、IL-8、TNF-α水平依照ELISA试剂盒阐明书步骤分别检测各组细胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α水平。

（2）流式细胞仪检测各组细胞凋亡运用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，1 500 r·min-1离心5 min，PBS洗2次后，用100 L分离缓冲液重悬细胞，参与5 L Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min，上机前5 min参与10 L PI，并在流式管中补加400 L PBS，流式细胞仪检测，Flowjo软件剖析结果。

（3）qRT-PCR检测中心靶点PTGS2、MAKP3、MMP-9mRNA表白提取细胞总RNA，检测RNA浓度，反转录为cDNA，进行荧光定量PCR反响，反响条件：95 ℃，10 min；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；40次循环。以GAPDH作为内参，数据采用2-ΔΔ C t 措施进行剖析。

1.3统计学措施

数据采用SPSS 20.0统计软件进行剖析，以表示。多组样本间比较采用单要素方差剖析，方差齐时，用LSD法进行多重比较，方差不齐则采用非参数检验。P＜0.05表示差别具有统计学意义。

2结果

2.1网络药理学及分子对接研讨结果

2.1.1麻黄细辛附子汤治疗AR的作用靶点预测经过检索得到麻黄细辛附子汤活性成分62个，见表2，作用靶点247个，AR靶点2 029个。将麻黄细辛附子汤成分靶点与AR疾病靶点取交集后得到99个共同靶点，见图1。用Cytoscape软件构建中药-活性成分-靶点网络，见图2。对节点拓扑参数进行剖析，其中槲皮素、山柰酚、芹菜素、木犀草素、伪麻黄碱、麻黄碱、豆甾醇度值均≥20，可能是麻黄细辛附子汤治疗AR的主要活性成分。

2.1.2PPI网络与中心靶点剖析应用STRING平台将99个交集靶点进行PPI网络构建，见图3。运用Cytoscape-CytoNCA插件对度中心性（DC）、中介中心性（BC）、紧密中心性（CC）、特征向量中心性（EC）、网络中心性（NC）和部分平均连通性（LAC）值进行计算，以中位数为规范进行2次选择，取得33个关键靶点，其中包含PTGS2、MAPK3、MMP-9、JUN、CASP3、AKT1等14个中心靶点，见图4。

2.1.3GO和KEGG富集剖析GO 剖析结果表明，靶点主要触及对脂多糖的反响、对细菌来源分子的反响等BP；参与调理G蛋白偶联胺受体活性、细胞因子受体分离、细胞因子活性等MF；富集于膜筏、微膜区等CC，见图5。KEGG剖析结果表明，基因主要富集于白细胞介素-17（IL-17）、肿瘤坏死因子（TNF）、辅助性T细胞（Th）17分化、核因子-κB（NF-kappa B）等免疫炎症相关通路；磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、细胞凋亡等细胞存活、分化、增殖、凋亡相关通路，见图6。

2.1.4分子对接结果应用Autodock软件将中药-活性成分-靶点网络中度值最高的7个活性成分与PPI网络中6个中心靶点进行分子对接，取得分离能，见表3。普通以为分离能越小代表靶基因与活性成分分离越紧密，分离能小于-17.78 kJ·mol-1表示配体与受体有一定的分离活性，小于-20.92 kJ·mol-1有较好的分离活性，小于-29.29 kJ·mol-1有激烈的分离活性［ 14］。结果显现，除了麻黄碱、伪麻黄碱与JUN、CASP3有一定的分离活性，其他活性成分与靶点之间具有较好或激烈的分离活性。依据分离能大小，将PTGS2、MAPK3、MMP-9与槲皮素、山柰酚、芹菜素、木犀草素对接结果进行可视化，见图7，后续实验选择此3个靶点进行考证。

2.2体外实验考证结果

2.2.1麻黄细辛附子汤对细胞活性的影响CCK8 检测结果显现，与对照组比较，麻黄细辛附子汤质量浓度低于20 mg·mL-1对细胞存活率影响不显著，而麻黄细辛附子汤质量浓度为50 mg·mL-1时，细胞存活率显著降低（P＜0.01），见表4，因而选择5、10、20 mg·mL-1的给药质量浓度进行后续实验。

2.2.2麻黄细辛附子汤对LPS诱导的HNEpC细胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α水平的影响与对照组比较，模型组上清液中IL-6、IL-8、TNF-α水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，麻黄细辛附子汤各给药组上清液中IL-6、IL-8、TNF-α水平显著降低（P＜0.05、0.01），见表5。

2.2.3麻黄细辛附子汤对LPS诱导的HNEpC细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果表明，与对照组比较，模型组细胞凋亡率显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，麻黄细辛附子汤各给药组细胞凋亡率显著降低（P＜0.01），见表6和图8。

2.2.4麻黄细辛附子汤对LPS诱导的HNEpC细胞PTGS2、MAPK3、MMP-9mRNA表白的影响与对照组比较，模型组细胞中PTGS2、MAPK3、MMP-9 mRNA表白水平显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，麻黄细辛附子汤各给药组干预后细胞中PTGS2、MAPK3mRNA表白水平显著降低（P＜0.05、0.01），MMP-9mRNA表白水平显著增加（P＜0.05、0.01），见表7。

3讨论

AR是多种免疫细胞、细胞因子和炎症介质等参与的鼻黏膜非感染性炎症疾病，常重复发作，拖延不愈［ 15］。目前AR的常见治疗措施有减少过敏原裸露、药物治疗、过敏原特异性免疫治疗，但相关反作用较多，所需周期较长，缺乏远期疗效，相比之下，中医药治疗AR有明显优势［ 16-18］。AR多属风寒外束，气虚阳衰病症，而麻黄细辛附子汤有散寒温阳、统筹表里之效，是AR的对症之方。研讨表明，本方可经过干预多细胞-多靶点、调理免疫炎症反响、干预凋亡、代谢等过程治疗AR，但其确切药理学机制远未阐明［ 19］。

本研讨经过中药-活性成分-靶点网络选择出槲皮素、山柰酚、芹菜素、木犀草素等重要活性成分。槲皮素具有抗炎及调理免疫功用作用，能够抑止组胺和促炎介质分泌，调理Th1/Th2均衡，减少IgE产生［ 20］。山柰酚能够减轻AR小鼠过敏反响病症，下调白细胞介素-32（IL-32）、胸腺基质淋巴生成素（TSLP）、环氧合酶-2（COX-2）等多种炎症标记物的表白［ 21］。芹菜素、木犀草素经过抑止Th2反响，如白细胞介素-4（IL-4）、转录因子GATA分离蛋白3（GATA-3）、信号传导及转录激活因子6（STAT6）等表白，激活Th1反响，如γ-干扰素（IFN-γ）、转录因子T-bet分离蛋白（T-bet）等表白从而调理AR中Th1/Th2的均衡［ 22-23］。本课题组前期研讨曾经证明麻黄细辛附子汤能够调控IL-4/STAT6通路，促进IFN-γ分泌，抑止IL-4分泌，升高T-bet/GATA-3值，干预顺应性免疫过程［ 24-26］，本研讨结果提示芹菜素、木犀草素很有可能是麻黄细辛附子汤治疗AR的关键物质基础。

PPI网络剖析选择出了PTGS2、MAPK3、MMP-9、AKT1、CASP3等中心靶点，主要触及PI3K-Akt、MAPK、IL-17信号通路。AR的发病过程中，肥大细胞脱颗粒释放组胺、前列腺素等多种介质，激活效应细胞，介导炎症反响［ 27］。PTGS2能够催化前列腺素的合成，抑止PTGS2表白能够增强抗过敏活性、减轻AR气道炎症［ 28］。MMP-9能够降解、重塑构成细胞外基质的蛋白质［ 29］，与维持正常组织结构、创伤愈合、炎症反响等多种生理病理过程密切相关［ 30］。MMP-9表白上调会加剧呼吸道炎症，增加嗜酸性粒细胞数量和炎性细胞因子水平［ 31］。但是，与本实验结果分歧，另外一些研讨以为，MMP-9表白增加能够促进呼吸道上皮组织愈合，关于变应性疾病的发作、延展起到维护性作用［ 32］。CASP3是细胞凋亡途径中最下游的酶之一，激活CASP3会招致DNA降解和细胞凋亡［ 33］。AKT1和MAPK3分别经过PI3K/Akt和MAPK信号通路参与AR的调理。

PI3K/Akt和MAPK信号通路对AR多种效应细胞均有干预作用，PI3K/Akt信号通路参与调理Th1/Th2免疫失衡［ 34］，调理性T细胞（Treg）细胞分化［ 35］，2型固有淋巴细胞（ILC2）转录因子、细胞因子表白［ 36］，肥大细胞脱颗粒等［ 37］。MAPK信号通路激活能够促进Th2细胞分化，B细胞合成IgE［38］，嗜酸性粒细胞迁移［ 39］，杯状细胞增殖、黏液高分泌［ 40］，上皮细胞屏障破坏［ 41］等。抑止PI3K/Akt、MAPK通路可减轻AR反响［ 42-43］。IL-17主要由Th17细胞产生，对AR有着双向的调控作用，不只能够募集多种免疫细胞促进AR发作，还能抑止肥大细胞脱颗粒，下调促炎细胞因子表白控制AR发病［ 44］。

研讨表明，IL-6、IL-8、TNF-α等炎性细胞因子、趋化因子在AR患者鼻黏膜中高表白，能够启动AR并加剧呼吸道炎症损伤［ 45-46］。本实验采用LPS干预HNEpC细胞构建AR体外模型，麻黄细辛附子汤各给药组干预后能够降低IL-6、IL-8、TNF-α分泌水平，且能够抑止细胞凋亡，对HNEpC细胞起到维护作用。进一步采用qRT-PCR技术对中心靶点进行考证，结果显现，麻黄细辛附子汤各给药组能够降低PTGS2、MAPK3mRNA表白，升高MMP-9mRNA表白。体外实验中麻黄细辛附子汤作用呈一定的剂量相关性。以上结果表明，麻黄细辛附子汤可能经过调控PTGS2、MAPK3、MMP-9等中心靶点，调理免疫、炎症、细胞凋亡等途径发挥治疗AR的作用。本研讨经过生物信息学技术［ 47］进一步论述了麻黄细辛附子汤治疗AR的微观分子机制，并对后续相关研讨有一定的启示作用。