Nanodisc 在 GPCR 抗体研发中的应用

一、GPCR简介

GPCR（ Guanosine-binding Protein Coupled Receptor）中文称号为G蛋白偶联受体，是一种膜蛋白受体。GPCR作为细胞信号传导中的重要蛋白，其共同点是其蛋白体结构中都有七个跨膜结构。研讨显现GPCR参与了很多细胞信号转导过程，当膜外的配体作用于该受体时，该受体的膜内部分与G蛋青丝生分离，从而激活G蛋白。G蛋白可经过两种途径传送细胞外的信息：第一种方式是翻开跨膜离子通道，让外界的离子进入；第二种方式是激活第二信使，如：cAMp、IP3/DAG等。简单来讲，GPCR能分离细胞周围环境中的化学物质并激活细胞内的一系列信号通路，惹起细胞状态和功用的改动，同时参与多种生命活动以及内分泌与代谢等多种生理过程。从疾病方面来看，GPCR也与糖尿病、心脏病、肿瘤、免疫疾病等重要疾病的发作、展开及治疗密切相关。

随着科研和生物医药范畴展开的不时深化，GPCR的重要性也愈发显现，为了惩处在这一范畴的贡献，2012年诺贝尔化学奖授予了两位美国科学家：罗伯特·莱夫科维茨（Robert J. Lefkowitz）和布莱恩·科比尔卡（Brian K. Kobilka），他们因“G蛋白偶联受体”研讨范畴的出色贡献而获奖。从生物医疗范畴的数据来看，大约40%的现代药物都以GPCR作为靶点。而至少有三分之一的小分子药物是GPCR的激活剂或者拮抗剂，在畅销药物排行中就有众多药物属于GPCR相关药物，好比：充血性心力衰竭药物Coreg、高血压药物Cozaar、乳腺癌药物Zoladex等，而还有更多这样的候选药物小分子在临床研发中。

针对GPCR的分类，主流有两种措施：一是A-F分类系统，面向一切生物体内的GPCR蛋白；第二种是将GPCR蛋白被分为Glutamate、Rhodopsin、Adhesion、Secretin、Frizzled/TAS2这5类。依照第二种分类规范来看，Rhodopsin受体类是GPCR家族中大的一类，而其下还分为多种亚家族。而整个Rhodopsin家族包含各种重要受体，如组胺受体、多巴胺受体、内皮素受体、催产素受体等。而其它类GPCR也包含众多受体种类，如钙敏感受体、甜味味觉受体等。

二、GPRC单抗药物开发

现阶段，作为开发药物靶点的受体约370个，散布于Glutamate、Rhodopsin、Adhesion、Secretin、Frizzled/TAS2 五大家族内。这些GPCR主要与生理代谢和疾病的构成有关，包含癌症、炎症、感染、代谢疾病等。药物作用于GPCR靶点，其主要的作用是阻断或激活胞外信号对靶点的激活，调控由靶点介导的胞内信号传导以及阻断病毒经过靶点侵入。作用于GPCR受体的药物能够是小分子药物或抗体类药物，相关于小分子药物，单克隆抗体药物治疗GPCR相关疾病具有多方面优势。抗体在体内的肃清率更低，作用时间更长；并且在给定剂量下，抗体的血浆浓度的个体差别更小。另一方面在药物开发方面，关于一些受体，小分子药物经过高通量选择阶段的阳性率很低，成药难度大。此外单抗药物能够具有对受体更高的特异性以及避免一些小分子要会带来的反作用，如小分子药物能够穿过血脑屏障惹起药反作用。现针对GPCR受体，用于治疗癌症、炎症和感染的很多抗体药物曾经进入临床或上市，而更多的其它抗体药物正在加紧研发的过程中。

三、GPCR靶点的抗体药物研发中需求处置的抗体制备相关问题

现GPCR抗原主要方式有： GPCR全长蛋白、合成的GPCR胞外N端或loop区域、带有膜蛋白的细胞膜碎片、过表白GPCR的细胞、带有GPCR的脂质体、带有GPCR的类病毒颗粒等。各种措施各有特性，现就其存在的问题做一个简单描画。

图1.GPCR抗原主要方式（来源：参考文献3）

全长GPCR作为抗原的优势在于比较纯真且相对接近自然构象，但艰难在于取得了全长蛋白后其原包裹在细胞膜内的疏水域也裸露在外，这样容易筛到分离跨膜区的抗体。同时由于疏水域裸露在外，蛋白也容易发作汇集影响正确抗体的构成。关于合成胞外N端或loop区制造抗原的措施相对简单，但它们可能无法模仿蛋白的全部自然构象，表位容易遗漏和失真。带有膜蛋白的细胞膜碎片和过表白GPCR的细胞由于目的GPCR在整个膜上含量比例很低，因而会给选择带来很高的背景从而影响结果。脂质体和类病毒颗粒作为GPCR蛋白的载体能够有效降低选择背景，是往常效果较好的措施之一，但由于脂质体的不稳定性，招致在在应用时有无法忽视的局限。

选择措施分为体内免疫和展示选择。其中体内免疫法是常用和经典的措施之一，经过用抗原免疫动物，然后从动物的脾脏中分别B细胞，制备杂交瘤，选择单克隆抗体。而能否能更好的得到产生目的抗体的B细胞，用与惹起免疫反响的抗原的稳定性、单一性、希冀产生抗体分离的位点能否外露、不希冀产生抗体分离的部分能否被包裹都显得尤为重要。

四、Nanodisc用于GPCR抗体的制备

Nanodiscs是由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins, MSPs)和磷脂分子构成的磷脂双分子层类膜结构。经过这种特殊的结构，GPCR能够整合到Nanodiscs中，坚持其生物学活性，为GPCG的研讨提供了有力的技术支持。膜支架蛋白(MSPs)是载脂蛋白(apo) A-I的缩减版，它们包绕着脂质双分子层从而构成圆盘状的结构，即纳米盘。其包含一个朝向内部脂层的疏水面和朝外的亲水面。这一结构使得Nanodiscs在水溶液中具有很高的溶解度，同时具有十分高的稳定性。经过Nanodisc包裹，纯化后的GPCG在坚持空间结构稳定和活性的同时，也将不希冀裸露的跨膜域好像在细胞膜内一样包埋在磷脂双分子层内部。

图2：膜蛋白组装到Nanodiscs的原理图。绿色：膜支架蛋白（MSPs）；灰色：磷脂；橙色：膜蛋白(来源Cube Biotech)

五、Nanodisc包裹纯化后的GPCR用于抗原制备有众多优势

1、Nanodisc能够为GPCR提供一个相似细胞膜双分子层的结构，使其原有的结构和功用能够被维护。同时跨膜区域和膜外区域也能和在细胞膜上分歧，避免了直接运用纯GPCR作为抗体会产生的分离跨膜区域的抗体构成的问题。同时，经过Nanodisc包裹的GPCR作为抗原也避免的直接运用细胞膜碎片作为抗体会惹起高背景等问题，使后续选择难度大大降低。

2、Nanodisc 包裹完好GPCR，不会有运用合成胞外N端或loop区制造抗原构成的表位容易遗漏和失真的问题。

3、Nanodisc经过膜支架蛋白固定磷脂，使其结构十分稳定，从而避免了运用脂质体包裹GPCR作为抗原的不稳定和易决裂等问题。

4、为了针对不同的应用请求，膜支架蛋白能够是人源化或鼠源化的，如此能够避免用鼠作为免疫动物，人源化的膜支架蛋白会惹起不用要的免疫反响。

六、将膜蛋白组装到Nanodiscs中的两种措施

措施1：组装溶解在去污剂中的膜蛋白

在去污剂存在条件下将GPCR纯化，然后再添加MSPs和磷脂。含有膜蛋白的Nanodiscs能够自发地组装，在去除掉名义活性剂后能够经过凝胶过滤（排阻层析）等方式来纯化。

措施2：Nanodiscs与无细胞表白体系相分离

另一个措施是，GPCR在无细胞表白体系中被表白，经过参与曾经和GPCR分离预先组装的Nanodiscs，膜蛋白能经过无细胞表白系统表白出来。

图3：膜蛋白与Nanodisc的两种组装机制(图片来源Cube Biotech官方网站)

左图：膜蛋白（橙色）溶解在去污剂（深灰色）中并与冻干的MSP（绿色）和磷脂（浅灰）混合。然后去除去污剂，构成蛋白-Nanodisc复合物。右图：预组装了MSP与磷脂的Nanodiscs参与到无细胞反响液（cell-free expression systems）中，重生的GPCR能够自发地组装到Nanodiscs中。

GPCR作为药物靶点在未来有着庞大的潜力，随着单克隆抗体研发相关技术和产品的丰厚，在可见的未来将会有越来越多针对各类疾病的优秀药物产品推向市场！

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20. 基于GPCR家族的抗体研发现状和瞻望-公众号生物制药小编文章

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23. 诺贝尔化学奖:G蛋白偶联受体-生物通文

24. 生物制药小编

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